potencjały wywołane

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Konferencja „Nowe metody w neurobiologii” 15 grudnia 2004 49−55
Identyfikacjastanufunkcjonalnegomózguprzypomocy
nowych metod analizy potencjałów wywołanych
Marek Wypych
1
i Andrzej Wróbel
1,2
1
Zakład Neurofizjologii, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3,
02-093 Warszawa;
2
Wydział Psychologii, Szkoła Wyższa Psychologii Społecznej,
ul. Chodakowska 19/31, 03-815 Warszawa
Summary
Due to high temporal resolution elektrophysiological methods are most appropriate for studying functional mechanisms of
the brain. Among them, recordings of field potentials (LFPs) from limited number of cells provide the best insight into the
local information processing within the known neuronal circuitry. Synchronous changes of LFPs recorded at different levels
of sensory processing in response to external stimuli are called evoked potentials (EP). In addition to sensory volley EPs con-
tain additional information about the functional state of the tissue in given recording site and thus provide the possibility for
studying brain dynamics. Thanks to progress in mathematical methods of signal analysis the sources of EPs can be calculated
for different brain states, and therefore mechanisms of information processing underlying different behavior, understood.
In this paper we describe two methods of classification of single EPs developed in our laboratory, which are based on princi-
pal component analysis (Musiał i in. 1998b) and wavelet analysis (Wypych i in. 2003). These methods can be used for online
identification of brain states.
Key words
: evoked potentials, classification, brain dynamics
Procesy funkcjonalne mózgu, zarówno automa-
tyczne jak i kognitywne odbywają się w stosunkowo
krótkim czasie, rzędu dziesiątek do setek milisekund.
Podstawową metodą umożliwiającą obrazowanie sta-
nów funkcjonalnych mózgu w celach badawczych jak
i diagnostycznych pozostaje więc, od stu przeszło lat,
bezpośrednia rejestracja jego aktywności elektrycznej.
Inne, pośrednie metody obrazowania (PET, fMRI),
nie mają wystarczającej rozdzielczości czasowej (PET
– minuty, fMRI – sekundy) aby śledzić dynamikę
przetwarzania informacji w sieci neuronalnej mózgu.
Trudności interpretacyjne ograniczające zrozumienie
złożonych sygnałów elektrycznych zostały w ostatnich
latach w dużej części pokonane dzięki rozwojowi ma-
tematycznych metod analizy i modelowania oraz udo-
godnieniom nowoczesnej aparatury rejestrującej. W
tym artykule przedstawiamy kilka popularnych metod
analizy sygnałów elektrofizjologicznych i wskazujemy
możliwości ich zastosowania do funkcjonalnej analizy
aktywności mózgu zwierząt, ze szczególnym uwzględ-
nieniem techniki potencjałów wywołanych stosowa-
nych w naszej pracowni.
Źródła elektrycznej aktywność mózgu
i metody ich rejestracji
Zmiany potencjału rejestrowane technikami elektro-
fizjologicznymi w tkance mózgu są wynikiem otwie-
rania się kanałów jonowych w błonach pobudzonych
neuronów, co umożliwia przepływ jonów (prądu elek-
trycznego) i powoduje lokalne zmiany potencjału elek-
trycznego w danym obszarze mózgu. W zależności od
oporności i wielkości elektrod rejestruje się przypływy
prądu (poprzez związane z nimi zmiany potencjału)
różnej wielkości: od powstających w wyniku otwarcia
pojedynczych kanałów (technika łatkowa, ang.
patch
clamp
), poprzez rejestracje postsynaptycznych i wol-
nych potencjałów wewnątrzkomórkowych, które po-
zwalają badać procesy integracyjne w pojedynczych
neuronach, rejestracje zewnątrzkomórkowe szeregów
potencjałów czynnościowych, rejestracje wolnych po-
tencjałów polowych (ang.
local field potentials
, LFPs)
powstających w wyniku uśredniania prądów postsynap-
tycznych licznej populacji komórek z wybranej struk-
tury mózgu, aż do wykorzystywanych w praktyce kli-
50
M. Wypych i A. Wróbel
nicznej pomiarów z powierzchni kory (elektrokortiko-
gram, ECoG) lub skóry czaszki (elektroencefalogram,
EEG), gdzie rejestruje się średnią aktywność komórek
z dużych pól korowych.
Elektroencefalografia jest najpopularniejszym ba-
daniem aktywności kory mózgu. Metoda ta jest sto-
sunkowo tania i całkowicie nieinwazyjna (rejestrujące
elektrody przylepione są do skóry czaszki), ma jednak
słabą rozdzielczość przestrzenną, a rejestrowane zmia-
ny potencjału są zniekształcane przez warstwy płynu
mózgowo-rdzeniowego, kości i skóry. Dlatego cza-
sem (także w badaniach ludzi) wykonuje się trepana-
cje czaszki i rejestruje zmiany potencjału elektrodami
umieszczonymi na oponie twardej, lub bezpośrednio
na powierzchni kory (ECoG). Interpretacja EEG i
ECoG jest trudna. Komórki piramidalne wewnętrznych
warstw kory mózgowej sięgają dendrytami apikalnymi
aż do warstwy powierzchniowej, gdzie kontaktują się
z aferentami (aksonami) doprowadzającymi pobudze-
nie z innych okolic kory. Aktywacja synaptyczna api-
kalnych dendrytów komórek piramidalnych powoduje
wpływ jonów dodatnich i względny spadek potencja-
łu w przestrzeni międzykomórkowej wokół nich (tzw.
zlew prądu, Ryc. 1). Ta zmiana potencjału wywołuje
przepływ jonów w niskooporowej przestrzeni między-
komórkowej wytwarzając względne źródło prądu w po-
bliżu ciał komórkowych i powstanie dipola elektrycz-
nego z ujemnym potencjałem przy powierzchni kory,
który jest rejestrowany przez elektrodę. W przypadku
pobudzenia neuronów przez aferenty przychodzące ze
wzgórza wytwarza się lokalny spadek potencjału (zlew)
w środkowych warstwach kory, a względne źródło przy
powierzchni jest rejestrowane jako wzrost potencjału
(Ryc. 1). Odwrotnie, zsynchronizowone hamowanie
wyższych lub niższych warstw zostanie zarejestrowane
odpowiednio jako wzrost lub spadek potencjału. Tak
więc, obserwując w sygnale wzrost potencjału nie mo-
żemy jednoznacznie stwierdzić, czy jest on wynikiem
pobudzenia neuropilu niższych warstw, czy hamowa-
nia w wyższych.
Znacznie wyższą rozdzielczość przestrzenną ma
badanie wolnych potencjałów polowych przy pomocy
elektrod (o oporności rzędu kilkuset kΩ) umieszczo-
nych bezpośrednio w tkance mózgu. Tak rejestrowany
sygnał (LFP), jest wypadkową aktywności postsynap-
tycznej wszystkich komórek znajdujących się w pobli-
żu czubka elektrody. W zależności od rodzaju aktyw-
nych synaps – pobudzeniowych lub hamujących, lokal-
na elektroda rejestruje odpowiednio spadek lub wzrost
zbiorczego potencjału zewnątrzkomórkowego.
W celu badania układów zmysłowych stosuje się
technikę potencjałów wywołanych (ang.
evoked poten-
tial
, EP). Sygnały te reprezentują synchroniczną zmia-
nę potencjału polowego „wywołaną” prezentacją bodź-
ca zmysłowego (np. poruszeniem wibrysy, zapaleniem
plamki świetlnej, emisją dźwięku itp.), a ich krótkola-
tencyjne składowe są rejestrowane w strukturach zaj-
mujących się przetwarzaniem informacji danej modal-
ności. EP reprezentują średnią aktywność grupy blisko
położonych, a więc również podobnych funkcjonalnie,
komórek, co pozwala na określenie stanu ich wzbudze-
nia w chwili zadziałania bodźca. Potencjały wywołane
pozwalają więc na próbkowanie aktywności tkanki mó-
zgowej w trakcie doświadczenia co umożliwia określe-
nie dynamiki aktywności sieci neuronalnej w miejscu
rejestracji, w zmieniających się sytuacjach behawioral-
nych (Musiał i.in. 1998a, Quiroga i van Luijtelaar 2002,
Wróbel i in.1998, Wypych i in. 2003). Podejście takie
zgodne jest z najnowszymi hipotezami sugerującymi,
że przetwarzanie informacji zmysłowej odbywa się
jednocześnie w dużych obszarach kory mózgu związa-
nych aktywną siecią połączeń poziomych (Arieli 2004,
Nunez 2000, Roland 2002, Wróbel 2000).
Podstawową zaletą rejestracji potencjałów polowych
(LFP, EP) w stosunku do metody rejestracji aktywno-
ści z pojedynczych komórek jest więc możliwość ba-
dania dynamiki lokalnego stanu sieci komórek mózgu
w trakcie zachowania się zwierzęcia, gdyż nie wymaga
ona wielokrotnego powtarzania bodźca w celu uzyska-
Ryc. 1. Znak potencjału zbiorczego rejestrowanego przez elektrody
naczaszkowe zależy od głębokości, na której powstaje pobudzenie
postsynaptyczne.
Identyfikacja stanów mózgu na podstawie analizy EP
51
nia uśrednionej w czasie odpowiedzi. Zważywszy, że
ustalenie „typowej” reakcji komórki wymaga również
uśredniania w populacji neuronalnej i, często, wielu
zwierząt, traci się możliwość analizy specyficznych po-
łączeń funkcjonujących w unikatowej sieci określonego
mózgu. Tymczasem, informację o stanie wzbudzenia
grupy neuronów w chwili podania bodźca niesie rów-
nież pojedynczy EP (Creutzfeldt i in. 1966, Eckhorn i
Obermueller 1993), o ile tylko potrafimy zanalizować
jego komponenty składowe (Ryc. 2).
W ostatnich latach powstało wiele nowoczesnych
metod analizy sygnałów, które pozwalają wnioskować
o dynamice działania układów zmysłowych na podsta-
wie zmienności pojedynczych EP (np. Kublik 2000,
Quiroga i van Luijtelaar 2002, Wypych i in. 2003).
Najprostszym sposobem jest mierzenie a m p l i t u d y
głównej fali kolejnych potencjałów wywołanych (np.
Castro-Alamancos i Connors 1996, Musiał i in. 1998a).
Podejście takie zaniedbuje jednak większość informa-
cji zawartej w przebiegu sygnału i jest mało odporne
na szum. Większość z nowych metod analizy bazuje na
znalezieniu podstawowych składowych (parametrów)
w serii kolejnych EP i ich określeniu w pojedynczych
rejestracjach. Z tego powodu współczesne metody ana-
lizy sygnałów starają się przedstawić przebiegi EP w
postaci sumy określonych funkcji, które mogą być za-
dane arbitralnie lub być określone specjalnie dla bada-
nych danych (np. Bartnik i in. 1992, Boratyn i in. 2002,
Musiał i in. 1998b, Wypych i in. 2003). Analitycznie,
metody te polegają na dopasowaniu współczynników
badanego przebiegu w bazie odpowiednich funkcji.
W kolejnych krokach metody te analizują wielkość
wkładu tych funkcji do pojedynczych sygnałów.
Pierwszą metodą stosowaną do analizy całego przebie-
gu EP, była a n a l i z a s k ł a d o w y c h g ł ó w n y c h
(ang.
principal component analysis
, PCA), w której sy-
gnały przedstawia się w postaci sumy głównych funkcji
składowych znalezionych specjalnie dla posiadanego ze-
stawu sygnałów (Musiał i in. 1998b). Założeniem PCA
jest wyjaśnienie zmienności badanych EP przez względne
zmiany ich kilku głównych składowych, które można in-
terpretować jako‚ "wkłady" od niezależnych generatorów
rejestrowanego sygnału. W ostatnich latach sygnały EP
przedstawia się często przy pomocy specjalnie opracowa-
nych baz gotowych funkcji. Ze względu na wiele swych
matematycznych i praktycznych zalet, najlepiej spraw-
dzają się tzw. b a z y f a l k o w e (ang.
wavelets
), które
z powodzeniem były wykorzystywane także do analizy
pojedynczych EP (np. Bartnik i in. 1992, Quiroga i van
Luijtelaar 2002, Wypych i in. 2003). Poniżej przedstawia-
my bardziej szczegółowy opis zastosowania obu metod.
Wybrane metody analizy potencjałów
wywołanych
Informacja o bodźcu, po dotarciu do rejestrowanej
grupy komórek, nakłada się na ich aktualny stan wzbu-
dzenia przez co kolejne bodźce zmysłowe wywołują
EP o różnym kształcie. W klasycznych metodach inter-
pretacji zmienność tę rozumiano jako szum i analizie
poddawano amplitudy fal składowych z uśrednionych
EP, tracąc tym samym możliwość badania zmian ak-
tywności mózgu w czasie.
Ryc. 2. Na potencjał wywołany rejestrowanego w korze baryłkowej
szczura składają się aktywności postsynaptyczne nad- (warsty 2-3)
i podziarnistych (warstwa 5-6) komórek piramidalnych. Kształt EP
koreluje z histogramami potencjałów czynnościowych po bodźcu.
Aktywność czynnościowa komórek w warstwach 2-3 jest nieco
wcześniejsza niż komórek w warstwie 5 (na podstawie Shimegi i
in. 1999, Wróbel i in. 1998).
Identyfikacjastanufunkcjonalnegokory
czuciowej szczura poprzez klasyfikację
potencjałów wywołanych poruszeniem
wibrysy
Szczególnym problemem w analizie potencjałów
wywołanych jest ich klasyfikacja, która na podstawie
52
M. Wypych i A. Wróbel
różnych przebiegów sygnału pozwala wnioskować,
że były one wywołane w różnych stanach aktywności
mózgu. W naszym laboratorium staramy się zrozumieć
mechanizmy bramkujące w zmysłowych układach ko-
rowo-wzgórzowych, które mogą być odpowiedzialne
za zmiany aktywności kory (habituacja, wzbudzenie,
uwaga). W tym celu rejestrujemy potencjały wywoła-
ne w korze baryłkowej szczura poruszeniem wibrysy
po długotrwałej habituacji tego bodźca, oraz w sytuacji
aktywacji kory wywołanej dodatkowym wzmocnie-
niem awersyjnym (lekki szok elektryczny podawany
na ucho zwierzęcia).
W pierwszych doświadczeniach pokazaliśmy, że
amplituda głównej fali postsynaptycznej (N1, Ryc. 2),
istotnie wzrastała po wzbudzeniu kory (Musiał i in.
1998a) oraz, że częstość występowania potencjałów
o niskiej i wysokiej amplitudzie zależała od kontekstu
– w okresie kontrolnym (po habituacji i bez dodatko-
wego bodźca) dominowały niskoamplitudowe EP, a w
okresie, w którym stymulacja wibrysy byłą kojarzona z
bodźcem awersyjnym, potencjały o dużej amplitudzie
fali N1 (Wróbel i in 1998).
Analiza składowych głównych (PCA)
Zastosowanie PCA do analizy EP rejestrowanych
z kory baryłkowej szczura pozwoliło wyróżnić dwie
główne składowe tych sygnałów, których zmienność
tłumaczy 90% całej wariancji EP u uśpionych szczu-
rów i ponad 70% u aktywnych (Musiał i in. 1998b,
Ryc. 3 B). Późniejsze doświadczenia z chłodzeniem
powierzchni kory pozwoliły zidentyfikować pierwszą
składową jako wynik aktywności nadziarnistych ko-
Ryc. 3. (A). Model połączeń w pierwszorzędowej korze czuciowej. Pobudzenie ze wzgórza trafia przez komórki ziarniste warstwy 4 do
komórek piramidalnych w warstwach 2-3, natomiast do komórek piramidalnych w warstwach 5-6 pobudzenie dociera zarówno bezpo-
średnio ze wzgórza jak i pośrednio z komórek nadziarnistych . Dlatego maksimum składowej z warstwy podziarnistej jest późniejsze, niż
z nadziarnistej. (B) Górny wykres przedstawia zbiór EP zarejestrowanych z kory baryłkowej nieuśpionego szczura. Dolny przedstawia
dwie główne składowe wyodrębnione metodą PCA. Wśród EP na górnym wykresie można zauważyć takie, w których kształcie wyraźnie
przeważa składowa główna I lub II (np. pogrubione, odpowiednio szary i czarny). (C) Klasyfikacja EP na podstawie wkładu głównych
składowych w kształt fali N1 (na podstawie Wróbel i in. 1998). W okresie kontrolnym przeważają EP klasy 1, a w okresie z pobudzeniem
awersyjnym, EP klasy 2.
Identyfikacja stanów mózgu na podstawie analizy EP
53
mórek piramidalnych (która znikała prędzej w wyniku
inaktywacji kory), a drugą składową przyporządkować
komórkom podziarnistym (Ryc. 3; Kublik i in. 2001).
Ta identyfikacja pozwoliła zaklasyfikować większość
z pojedynczych EP, rejestrowanych w czasie całego
okresu doświadczenia, do jednej z dwu klas, z których
pierwsza była zdominowana przez wcześniejszą kom-
ponentę (I), a druga przez późniejszą komponentę II
(Ryc. 3 C, Kublik 2004, Wróbel i in. 1998). Potencjały
pierwszej klasy występowały znacznie częściej w okre-
sie habituacji, a potencjały drugiej klasy pojawiały się
natychmiast po zastosowaniu bodźca awersyjnego i do-
minowały w okresie wzbudzenia kory. Wyniki te po-
zwoliły na przedstawienie funkcjonalnego modelu roz-
przestrzeniania się informacji zmysłowej o bodźcu, we
wzbudzonej korze baryłkowej (czyli po dyshabituacji,
Kublik 2004, Wróbel i in 1998).
rejestrowany sygnał. W przypadku występowania róż-
nych klas EP, liczby te mogą być potem rozdzielone
na grupy standardowymi metodami. Do analizy użyto
danych doświadczalnych z różnych zwierząt, rejestro-
wanych różnymi (mono- lub bipolarnymi) elektrodami,
umieszczonymi na różnych głębokościach kory. Z tego
powodu rejestracje z różnych zwierząt różniły się (Ryc.
6 A-B) i dlatego postanowiliśmy dla danych z każdego
szczura znaleźć oddzielną funkcję (Wypych i in. 2003).
Baza falkowa, to zbiór funkcji zbudowanych na podsta-
wie jednej wybranej funkcji poprzez jej ściskanie i prze-
suwanie (w osi czasu). Funkcja, która pozwala na zbudo-
wanie bazy falkowej musi spełniać odpowiednie warunki
(np. aby wszystkie funkcje w utworzonej bazie były nie-
skorelowane).
W analizie sygnałów zastosowanie znajdu-
je wiele baz falkowych z różnych rodzin. W naszej pra-
cy użyliśmy falki Daubechies D5 (Daubechies 1992)
ponieważ wcześniejsze prace dowiodły, że jej użycie
do przetwarzania sygnałów biomedycznych zapewnia
zachowanie zasadniczej informacji sygnałów wejścio-
wych (np. Szczuka i Wojdyłło 2001). Wykresy przy-
kładowych falek tej bazy przedstawia Ryc. 4 A.
Wyznaczanie współczynników falkowych polega na
liczeniu iloczynów skalarnych sygnałów z kolejnymi
funkcjami z bazy falkowej (kolejne przesunięcia na ko-
Analiza falkowa
W poszukiwaniu lepszych metod klasyfikacji poten-
cjałów wywołanych wzbudzanych w różnych stanach
tkanki mózgu zainteresowaliśmy się metodą falkową.
Z jej pomocą postanowiliśmy znaleźć funkcję której
iloczyn skalarny (czyli nieznormalizowana korelacja)
z przebiegiem EP da liczbę charakteryzującą każdy za-
Ryc. 4. (A) Metoda falkowa opiera się na liczeniu iloczynów skalarnych (rzutów) EP (powyżej, widoczne charakterystyczne fale N1 i P2)
z przesuwanymi / ściskanymi falkami D5 (dwie przykładowe pokazane niżej). (B) Górny wykres: fragmenty falki D5 (zawierające się w
oknie na Ryc. 4 A), które zostały wybrane jako „najważniejsze” funkcje F1 i F2. Pokazana jest także docelowa funkcja F (linia przerywa-
na). Dolny wykres przedstawia przykładowy pojedynczy EP w tej samej skali czasowej.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]

zanotowane.pl

doc.pisz.pl

pdf.pisz.pl

fotocafe.xlx.pl